染色質免疫共沉淀

染色質免疫共沉淀技術（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是研究體內蛋白質與DNA相互作用的有力工具，通常用于轉錄因子結合位點或組蛋白特異性修飾位點的研究。將ChIP與新一代測序技術相結合的ChIP-Seq技術，能夠高效地在全基因組范圍內檢測與組蛋白、轉錄因子等互作的DNA區段。

一、ChIP實驗操作流程

1.樣品準備與交聯

細胞收集后，用1%的formaldehyde處理細胞，交聯核酸與DNA結合蛋白；

2.超聲打斷染色質

裂解細胞，用超聲波將染色質超聲破碎成200－1000bp片斷；將片段分為兩份，一份用于免疫共沉淀，一份用于對照。

   圖1染色質免疫共沉淀實驗流程                                              圖2　超聲破碎后DNA電泳圖（lane2）

3.免疫共沉淀(IP)

取B步驟所得一份片斷與ChIP特異抗體結合進行免疫共沉淀，利用免疫磁珠法富集抗體復合物。

4.解交聯及純化DNA

將富集的DNA/蛋白復合物解交聯釋放DNA片段，并進行純化（IP DNA）；B步驟所得用于對照（Input DNA）的片斷作不進行IP實驗，但也要解交聯并純化。

5.DNA段PCR擴增

針對ChIP DNA, Input DNA及對照DNA的目的片段設計特異性引物并進行熒光定量PCR擴增。

6.結果分析

%Input=2(CtInput-CtChIP)×Fd×100%

Fold Enrichment = [%(ChIP/Input)] / [%( Negative control/Input)]

應用領域：

?  判斷DNA鏈的某一特定位置組蛋白修飾的類型

?  精確定位RNA polymerase II及其它反式因子在基因組上結合位點

?  組蛋白共價修飾與基因表達的關系的研究

?  轉錄因子結合位點和功能研究

產品優勢：

?  檢測覆蓋范圍廣：全基因組范圍內掃描目標區域；

?  檢測分辨率高：更利于精確定位目標區域；

?  樣本需要量低：需要的免疫沉淀后的DNA量可低至5-10ng；

?  可靠性好：避免了非特異性雜交，背景低；

?  性價比高：花費較少即可檢測全基因組，獲取準確豐富的信息。

1.基本信息分析

按照標準過濾原則對將raw data過濾成clean data；

raw data及clean data的數據量及Q20、Q30統計；

raw data及clean data測序質量分布圖，GC/AT含量分布圖，duplicate rate統計。

2.標準信息分析

比對到參考基因組并統計比對結果（需提供參考基因組信息）；

Peak calling得出Peak region report(CSC bedformat file)；

去除multiple  identical序列；

確定轉錄結合位點和組蛋白標記；

Peak相關基因的GO注釋分析；

多個樣本間peak及相關基因的差異分析。

3.高級信息分析

根據客戶的具體研究目的所開展的深入分析。

樣品要求：

1. 樣品類型：ChIP-DNA；

2. 樣品濃度：≥10 ng/μl；

3. 樣品總量：≥100 ng；單次實驗用量為30ng時實驗的可重復性較好，因此請盡可能提供較多的樣品；若單次ChIP后DNA量不夠，建議將2~3次ChIP的DNA合并在一起；

4. 樣品純度：OD260/280為1.8~2.2；

5.DNA片段大?。悍植荚?00~500bp范圍，且主要片段在～250bp（清晰的電泳圖或2100檢測結果）。

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