免疫組織化學(immunohistochemistry，IHC)

免疫組織化學是利用抗原抗體的特異性結合反應來檢測和定位組織和細胞中蛋白或其他物質的一門技術，它是免疫學和傳統組織化學相結合而形成的。免疫組織化學染色技術不僅有較高的敏感性和特異性，其特點是將形態學改變與功能、代謝變化結合起來，直接在組織切片，細胞涂片或培養細胞爬片上定位一些蛋白質和多肽類物質的存在，并可精確到亞細胞結構水平，結合電子計算機圖像分析系統或激光掃描共聚集顯微術等技術，對被檢物質進行定量分析。

免疫組化步驟

1、切片，烤片60 ℃，1h ；

2、脫蠟及復水

二甲苯10min，二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min，75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自來水1min，雙氧水1min；

3、50mL 30％H₂O₂ 加450mL蒸餾水，室溫10min，蒸餾水洗3次，每次3min；

4、微波修復

將切片浸入0.01M 枸櫞酸緩沖液，微波中最大火力（98℃-100℃）加熱至沸騰，冷卻（約5-10min），反復兩次；

5、將切片自然冷卻至室溫，PBS 洗滌3次，每次5min；

6、封閉，5％BSA，室溫20min，甩去多余液體；

7、滴加一抗，37℃，1h，或者4℃過夜；

8、PBS洗滌3次，每次3min；

9、滴加二抗，37℃，15-30min；

10、PBS洗滌3次，每次3min；

11、滴加SABC ，37℃，30min；

12、PBS 洗滌3次，每次5min；

13、1mL蒸餾水中分別滴加顯色劑，混勻；

14、 DAB顯色劑配置好后，滴加于切片，室溫，鏡下檢測反應時間（約5min）；

15、自來水沖洗干凈，過蒸餾水；

16、蘇木素復染2min ，自來水沖洗；

17、脫水

30％乙醇3min，50％乙醇3min，70％乙醇3min，80％乙醇3min，90％乙醇3min，95％乙醇3min，100％乙醇3min，二甲苯20min；

18、樹膠封片，鏡檢。

免疫組化常見問題分析

1、石蠟切片在染色過程中出現脫片現象：

(1) 烤片時間不夠，或溫度不夠，可以延長烤片時間和提高烤片溫度；

(2) 用含有多聚賴氨酸的玻片，可以購買到或這自己做；

(3) 有些組織本身就容易掉片，如骨組織等，操作時沖PBS 不要直接沖到組織上，沖到組織上方，讓它流下沖洗組織；

(4) 用高溫修復時，溫度驟冷也可能引起。

2、邊緣效應

(1) 組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫漂浮在液體中，每次清洗不易將組織下面試劑洗盡所致. 解決辦法：制備優質的膠片（APES或多聚賴氨酸），切出盡量薄的組織切片，不厚于4微米，組織的前期處理應規范，盡量避免選用壞死較多的組織；

(2) 切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊緣的試劑容易首先變干，濃度較中心組織高而致染色深。解決辦法：試劑要充分覆蓋組織，應超出組織邊緣2mm。用組化筆畫圈時，為了避免油劑的影響，畫圈應距組織邊緣3-4mm。

3、產生組織切片非特異性染色

(1) 抗體孵育時間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/ 二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。這是最重要的一條；

(2) 一抗用多克隆抗體易出現非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看；

(3) 內源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細胞多的組織），需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色；

(4) 非特異性組分與抗體結合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當增加濃度來加強封閉效果；

(5) DAB 孵育時間過長或濃度過高；

(6) PBS 沖洗不充分，殘留抗體結果增強著色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要；

(7) 標本染色過程中經常出現干片，這容易增強非特異性著色。

4、免疫組化染色呈陰性結果

(1) 抗體濃度和質量問題以及抗體來源選擇錯誤；

(2) 抗原修復不全，對于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復來打開抗原表位，以利于與抗體結合; 建議微波修復用高火4次*6min試試。有人做過實驗，這是最佳的時間和次數。若不行，還可高壓修復；

(3) 組織切片本身這種抗原含量低；

(4) 血清封閉時間過長；

(5) DAB 孵育時間過短；

(6) 細胞通透不全，抗體未能充分進入胞內參與反應；

(7) 開始做免疫組化，我建議你一定要首先做個陽性對照片，排除抗體等外的方法問題。

5、背景強

(1) 考慮一抗濃度高；

(2) 然后調整DAB 孵育時間；

(3) 也要考慮血清封閉時間是否過短；

(4) 適當增加抗體孵育后的浸洗次數和延長浸洗時間等。

【一站式整體科研服務，成就更高水平的科研成果】

標書基金實驗咨詢       表觀遺傳組學分析

課題實驗結題指導       細胞分子功能驗證

實驗培訓文章潤色       動物模型裸鼠成瘤

臨床檢測科研轉化       病理染色分子互作

合作流程：

全國免費電話：400-1500-535

公司郵箱：3405768204@qq.com

官方網址：www.inspirwellness.com

公司地址：合肥市高新區天達路2號安徽大學科技園創新樓5層