transwell遷移/侵襲實驗

細胞遷移與侵襲實驗將Transwell小室放入培養板中，小室內稱上室，培養板內稱下室，上下層培養液以聚碳酸酯膜相隔，將研究的細胞種在上室內，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養液中的成分可以影響到上室內的細胞，應用不同孔徑和經過不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進行共培養、細胞趨化、細胞遷移、細胞侵襲等多種方面的研究。 

遷移實驗（cell migration assay）

實驗步驟： 

（1）所有細胞培養試劑和Transwell chamber 放在37℃溫育； 

（2）待測細胞培養至對數生長期，消化細胞，用PBS和無血清培養基先后洗滌一次，用無血清培養基懸浮細胞，計數，調整濃度為2×105 /ml； 

（3）在下室（即24孔板底部）加入600－800μl 含10％血清的培養基，上室加入100－150μl細胞懸液，繼續在孵箱培養24小時； 

（4）用鑷子小心取出chamber，吸干上室液體，移到預先加入約800μl甲醇的孔中，室溫固定30分鐘； 

（5）取出chamber，吸干上室固定液，移到預先加入約800μl Giemsa染液的孔中，室溫染色15－30分鐘；

（6）輕輕用清水沖洗浸泡數次，取出chamber，吸去上室液體，用濕棉棒小心擦去上室底部膜表面上的細胞；

（7）用小鑷子小心揭下膜，底面朝上晾干，移至載玻片上用中性樹膠封片； 

（8）顯微鏡下取9個隨機視野計數，統計結果

注意事項 

（1）根據待測細胞體積大小選擇合適孔徑的chamber。常用的為8.0-μm孔徑（如AGS細胞），如果細胞體積較大可以考慮用10-μm孔徑； 

（2）根據待測細胞的遷移能力強弱調整細胞數和遷移時間。常規24-well chamber接種細胞數約為2≈5×104/well，遷移時間12≈36小時； 

（3）由于Corning公司的24-Transwell內含12個獨立的chamber，為了避免操作污染，每次實驗可預先另準備一塊24孔普通培養板（Corning）； 

（4）如果細胞遷移能力較弱，下室液體可用3T3細胞無血清培養24小時獲得的上清加50μg/ml FN（Fibronectin），具體可查閱相關文獻； 

（5）細胞懸液加入膜中央，盡量保證液面水平； 

（6）固定染色擦洗時動作小心，避免擦去膜底面的細胞。但一定要充分擦凈膜表面上未遷移的細胞，以免影響讀數。尤其是膜周邊上可用細牙簽或小鑷子纏上濕棉花擦洗，但要小心避免將膜戳破； 

（7）Chamber和膜上都無法標記，操作時應小心避免混淆實驗組和對照組； 

（8）充分晾干，避免殘留水分導致鏡下聚焦不一致。

細胞侵襲實驗 （cell invasion assay） 

操作步驟 

（1）Matrigel在4℃過夜融化； 

（2）用4℃預冷的無血清培養基稀釋Matrigel至終濃度1mg/ml，冰上操作； 

（3）在chamber上室底部中央垂直加入100μl稀釋后的Matrigel，37℃溫育4－5小時使其干成膠狀； 

（4）后續步驟同遷移實驗（1-8）。 

注意事項 

（1）Matrigel在過高或過低的溫度均易凝固，因此操作所需槍頭和離心管應提前在4℃預冷； 

（2）鋪膠時保證液面水平，膠的厚度均勻一致，切勿產生氣泡； 

（3）其他注意事項同遷移試驗。

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